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Please use this identifier to cite or link to this item: http://www.tede2.ufrpe.br:8080/tede2/handle/tede2/9381
Tipo do documento: Dissertação
Título: Caracterização de células viáveis e não cultiváveis em Xanthomonas citri pv. anacardii
Autor: LUCENA, Lucas Pontes de 
Primeiro orientador: GAMA, Marco Aurélio Siqueira da
Primeiro coorientador: ABURJAILE, Flávia Figueira
Primeiro membro da banca: SOUZA, Elineide Barbosa de
Segundo membro da banca: CARVALHO, Rodrigo Dias de Oliveira
Resumo: O cajueiro é uma planta originária do Brasil, concentrada principalmente na região Nordeste, cuja produtividade é consideravelmente afetada pela incidência de doenças. Apesar da maioria das doenças serem de etiologia fúngica, tem-se observado a ocorrência de doenças bacterianas, como a mancha angular e a mancha de Xanthomonas causadas por Xanthomonas citri pv. anacardii, em cajueiros cultivados nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte. O principal sintoma da mancha angular são manchas necróticas escurecidas, restritas pelas nervuras do limbo foliar, enquanto no caso da mancha de Xanthomonas, os sintomas são necroses nos frutos e nas nervuras secundárias das folhas da planta. A introdução de material propagativo infectado é a principal forma de disseminação da doença entre lavouras. Os principais meios de sobrevivência relatados de X. citri são restos culturais de ciclos anteriores do hospedeiro, hospedeiros alternativos, sobrevivência epifítica, endofítica e por meio de células viáveis e não cultiváveis (viable but nonculturable - VBNC) do patógeno. Neste último caso, VBNC não são observadas em meio de cultura, porém viáveis, permitindo a sobrevivência bacteriana. Fatores ambientais adversos capazes de inibir o desenvolvimento da bactéria podem induzir o estado VBNC, que tendem a se manter em baixa atividade metabólica durante longos intervalos de tempo, porém podendo ser revertido quando em condições favoráveis para o crescimento da bactéria. Diante disso, este trabalho objetivou a caracterização de células em estado VBNC em dois isolados pigmentados (CCRMTAQ13 e CCRMTAQ18) e um isolado apigmentado (IBSBF2579) de X. citri pv. anacardii. Para esse fim, os genomas dos três isolados foram obtidos do banco de dados do NCBI, anotados e, em seguida, analisados visando a identificação de genes codificados em condição de VBNC. Para avaliar o estado de VBNC, foi obtida uma curva de crescimento bacteriano, determinando-se a fase exponencial (log) e de morte dos isolados. Essas fases foram avaliadas quantificando-se a concentração de células por meio de PCR quantitativa (qPCR) com primers construídos com base no gene relA, seguindo-se a avaliação da patogenicidade das células em estado VBNC por meio de inoculações artificiais em cajueiros. Foram identificados 13 genes relatados como expressos no estado de VBNC nos genomas dos três isolados, sendo o gene relA selecionado para as análises de qPCR. Curvas de crescimento bacteriano in vitro construídas em meio de cultura NYD permitiram a determinação da quantidade de células totais viáveis presentes nas fases exponencial e de morte para os isolados CCRMTAQ13 (24/96h), CCRMTAQ18 (48/72h) e IBSBF2579 (96/168h). A caracterização do estado VBNC em X. citri pv. anacardii ocorreu pela comparação entre a quantidade de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) e a quantidade de cópias do gene relA/mL na fase de morte da curva de crescimento. No método de diluição seriada, na fase de morte foram obtidos 0 UFC/mL em CCRMTAQ13, 0,2 x 108 UFC/mL em CCRMTAQ18 e 0,07 x 108 UFC/mL em IBSBF2579. Através da qPCR, foram quantificadas 2,68 x 108 cópias do gene relA /mL em CCRMTAQ13, 2,38 x 108 cópias do gene relA /mL em CCRMTAQ18, e 7,34 x 108 cópias do gene relA /mL em IBSBF2579. A comparação dos dados quantitativos demonstrou valores até 100 vezes maiores nos ensaios por qPCR para a fase de morte. Para a variável período de incubação não houve interação significativa entre os isolados e as fases de crescimento, havendo diferenças significativas apenas entre as fases de crescimento (exponencial e de VBNC), com a fase LOG levando em média 1,91 dias para causar os primeiros sintomas. Para severidade, avaliada aos vinte dias após a inoculação, foi observada interação entre os isolados e as fases de crescimento, sendo o isolado CCRMTAQ18 na fase LOG, o de menor média (3,95 mm²), e o isolado IBSBF2579, a maior média (7,17 mm2). A caracterização das VBNC possibilita uma nova perspectiva para a diagnose de fitobactérias, e nesse estudo foi realizado o primeiro relato da ocorrência de VBNC em X. citri pv. anacardii, uma importante bactéria fitopatogênica para região Nordeste do Brasil.
Abstract: The cashew tree is a plant originating from Brazil, concentrated mainly in the Northeast region, whose productivity is considerably affected by the incidence of diseases. Although most diseases are of fungal etiology, bacterial diseases such as angular leaf spot and Xanthomonas spot caused by Xanthomonas citri pv. anacardii, in cashew trees grown in the states of Ceará and Rio Grande do Norte. The main symptom of angular leaf spot is darkened necrotic spots, restricted by leaf limb veins, while in the case of Xanthomonas spot, the symptoms are necrosis in the fruits and the secondary veins of the leaves of the plant. The introduction of infected seedlings is the main form of dissemination among crops. X. citri's main reported means of survival are crop residues from previous host cycles, alternative hosts, epiphytic, endophytic and viable but nonculturable cells (VBNC) survival of the pathogen. In the latter case, VBNC are not observed in culture medium, but viable, allowing bacterial survival. Adverse environmental factors capable of inhibiting bacterial development may induce VBNC status, which tends to remain in low metabolic activity for long periods of time but may be reversed when under favorable conditions for bacterial growth. Therefore, this work aimed the characterization of VBNC in two pigmented isolates (CCRMTAQ13 and CCRMTAQ18) and one nonpigmented isolate (IBSBF2579) of X. citri pv. anacardii. To this end, the genomes of the three strains were obtained from the NCBI database, annotated and then analyzed for the identification of genes encoded under VBNC condition. To assess the state of VBNC, a bacterial growth curve was obtained, determining the exponential (log) and death phase of the isolates. These phases were evaluated by quantifying cell concentration by quantitative PCR (qPCR) with primers constructed based on relA gene, followed by the evaluation of pathogenicity of cells in VBNC state by artificial inoculation in cashew trees. Thirteen genes reported as expressed in the VBNC state were identified in the genomes of the three isolates, and the relA gene was selected for qPCR analysis. In vitro bacterial growth curves constructed in NYD culture media allowed the determination of the amount of total viable cells present in the exponential and death phases for CCRMTAQ13 (24/96h), CCRMTAQ18 (48/72h) and IBSBF2579 (96/168h) isolates). The characterization of the VBNC state in X. citri pv. anacardii occurred by comparing the number of colony forming units (CFU / mL) and the number of copies of the relA gene/mL at the death phase of the growth curve. In the serial dilution method, at the death phase, 0 CFU/mL were obtained in CCRMTAQ13, 0.2 x 108 CFU/Ml in CCRMTAQ18 and 0.07 x 108 CFU / mL in IBSBF2579. Through qPCR, 2.68 x 108 copies of the relA / mL gene in CCRMTAQ13, 2.38 x 108 copies of the relA/mL gene in CCRMTAQ18, and 7.34 x 108 copies of the relA/mL gene in IBSBF2579. Comparison of quantitative data showed up to 100-fold higher values in the qPCR assays for the death phase. For the incubation period there was no significant interaction between isolates and growth phases, with significant differences only between growth phases (exponential and VBNC), with the LOG phase taking an average of 1.91 days to cause the first ones. symptoms. For severity, evaluated at twenty days after inoculation, interaction between isolates and growth phases was observed, being the CCRMTAQ18 isolate in the LOG phase, the lowest average (3.95 mm²), and the IBSBF2579 isolate, the highest average. (7.17 mm2). The characterization of VBNC allows a new perspective for the diagnosis of phytobacteria, and in this study the first report of the occurrence of VBNC in X. citri pv. anacardii, an important phytopathogenic bacterium for northeastern Brazil.
Palavras-chave: Caju
Anacardium occidentale L.
Podridão negra
Macha angular
Bactérias fitopatogênicas
Xanthomonas citri
Área(s) do CNPq: FITOSSANIDADE::FITOPATOLOGIA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco
Sigla da instituição: UFRPE
Departamento: Departamento de Agronomia
Programa: Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia
Citação: LUCENA, Lucas Pontes de. Caracterização de células viáveis e não cultiváveis em Xanthomonas citri pv. anacardii. 2019. 49 f. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.tede2.ufrpe.br:8080/tede2/handle/tede2/9381
Data de defesa: 26-Jul-2019
Appears in Collections:Mestrado em Fitopatologia

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